کلونینگ و بیان لیپاز مزوفیل باسیلوس بومی و بررسی قابلیت ترجمه پذیری کدون ها در مخمر پیکیا پاستوریس تحت کنترل دو پروموتر مختلف

لیپازها (تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولازها ec 3.1.1.3 ) هیدرولیز تری آسیل گلیسرول به اسیدهای چرب و گلیسرول را در حد فاصل لایه چربی و آب کاتالیز می کند.این آنزیم ها کاربردهای فراوانی در صنایع غذایی، کشاورزی، روغن، چوب و کاغذ، پزشکی و دارویی دارند. از مهمترین کاربردهای لیپاز استفاده در شوینده های خانگی برای از بین بردن لکه های چربی می باشد. لیپازهای باکتریایی نوترکیب بخش مهمی از تجارت آنزیم ها هستند. در این تحقیق لیپاز باکتریایی که قبلا" از یک باسیلوس پامیلوس( bacillus pumilus) بومی از خاک جداسازی و ژن مربوط به آن توالی یابی شده بود، در میزبان مخمری پیکیا پاستوریس(( pichia pastoris کلون و بیان شد. پس از تکثیر ژن لیپاز دارای توالی راهنمای باسیلوسی وبدون توالی راهنمای باسیلوسی (لیپاز بالغ) با روش pcr ، محصول pcr در وکتور pgem5zf کلون گردید. سپس ژن لیپاز از حامل کلونینگ خارج ودر حامل بیانی تحت کنترل دو پروموتر الکل اکسیداز و گلیسرآلدهیدفسفات دهیدروژناز کلون شده وسازه حاصل پس از تأیید کلونینک با روش های ملکولی و آنزیمی با روش الکتروپوریشن به درون مخمر بیانی پیکیا پاستوریس( pichia pastoris ) انتقال داده شد. بیان آنزیم لیپاز در محیط کشت بیانی تأیید آن با تست پارانیتروفنیل پالمیتات(pnpp ) و روش sds-page انجام شد. سپس برای بیان بهتر و بالای این آنزیم در مخمر، بهینه سازی قابلیت ترجمه پذیری کدون های ژن باسیلوسی براساس میزبان مخمری انجام و ژن بهینه به صورت مصنوعی ساخته شد و در درون ژنوم مخمر میزبان کلون وبیان شد.در نهایت میزان بیان این دو با هم مقایسه شد.